Typy fluorescenčních mikroskopů

Když byly vynalezeny mikroskopy kolem roku 1600 C.E., přirození filozofové obrátili své oči na svět ve světě. Když Antony van Leeuwenhoek vytvořil malé, vysoce zakřivené čočky a mechanický držák pro úpravu pohledu, otevřel okno do mikroskopického světa bakterií, krevních buněk, prvoky a buněčné struktury rostlin. Ale v celé historii mikroskopie vždy existovala jedna otázka: Jaké jsou tyto podivné věci viděné skrz objektiv? Fluorescenční mikroskopie označuje soubor technik, které minimalizují tuto nejistotu - protože ve fluorescenčním mikroskopu, kdy světlo svítí na vzorku, svítí vlastní světlo zpět.

Epifluorescence
Zdaleka nejběžnějším fluorescenčním mikroskopem je epifluorescenční konfigurace. V epifluorescenčním mikroskopu, světelný zdroj - typicky rtuťová nebo xenonová lampa - svítí skrz filtr, který vybírá úzkou oblast vlnových délek. Filtrované světlo svítí na vzorek skrz objektiv objektivu mikroskopu. Vstupující světlo je absorbováno fluorofory - molekulárními štítky, které emitují světlo dlouhé vlnové délky, když absorbují světlo kratší vlnové délky. Světlo z fluoroforů spolu s rozptýleným světlem ze zdroje osvětlení se vrací zpět do objektivu a do detektoru nebo oka. Podél cesty, další filtr blokuje světelné světlo, takže vše, co zbývá, je fluorescenční světlo ze vzorku.

Confocal
Epifluorescenční mikroskop shromažďuje světlo odkudkoliv v zorném poli mikroskopu . Část excitačního světla je absorbována před ohniskovou rovinou mikroskopu, některé v ohniskové rovině a některé mimo ohniskovou rovinu. Vzhledem k tomu, že mikroskop shromažďuje veškeré světlo, obraz bude obsahovat ostrý obraz světla v ohnisku, ale bude mít také ostré světlo z jiných oblastí. Konfokální mikroskop stanoví, že zaostřením laserového bodu ve stejné rovině jako je zaostřený mikroskop. Pak se před detektorem objeví dírka, kde blokuje veškeré světlo, které nepochází z mikroskopu. Skenováním vzorku lze získat čistý trojrozměrný obraz objektu.

Multiphoton
V konfokálním mikroskopu je vyrovnání velmi citlivé. Pokud laserový bod, objektiv mikroskopu, sběrná optika a dírka jsou mimo sebemenší množství, výkon mikroskopu trpí. Multifonní mikroskop obchází tento problém použitím vlnové délky laseru, která je jen poloviční jako energie, protože musí být schopna excitovat fluorofory ve vzorku. Jediný způsob, jak se fluorofory nadchnou a vydávají fluorescenci, je, pokud je laserové světlo dostatečně jasné, aby dvě částice světla - fotony - narazily na fluorofor ve velmi krátkém čase. To se děje pouze tehdy, když je laser zaostřen na velmi malém místě. Jediné místo ve vzorku, které bude vydávat světlo, je místo, kde je laser zaostřený, což udržuje obraz pěkný a čistý, protože tam není žádné další pozadí, které by se zbavilo - což znamená, že není nutné dírku srovnávat. Celková fluorescence vnitřního odrazu (TIRF)
Dalším způsobem, jak získat velmi čisté snímky, je zajistit, aby se excitační světlo nedostalo příliš daleko do vzorku. Je-li například do kapky roztoku na skleněném sklíčku vložen blok neuronů, pak některé z neuronů přilnou k povrchu skla. V mikroskopu s úplnou vnitřní reflexní fluorescencí (TIRF) je světlo nasměrováno do skla do sklíčka tak, aby se do roztoku neudrželo. Ale část světla jen stěží uniká do roztoku - jen velmi blízko povrchu skla. To znamená, že jediná místa, která budou emitovat světlo, budou ve velmi tenké oblasti přímo proti povrchu skla. Pro něco jako neurony, kde se na povrchu buněk děje tolik zajímavých věcí, může být tato technika velmi účinná.

Super-Resolution
Všechny mikroskopy - včetně fluorescenčních mikroskopů - jsou omezeny fyzika, která řídí šíření světla. Jedním ze základních pravidel je, že zaostřené místo světla může být tak malé - a ne menší. Pro viditelné světlo je tato velikost asi 200 nanometrů nebo 200 miliardtin metru. Jednotlivé molekuly však mají pouze několik nanometrů, takže existuje spousta zajímavých vlastností, které jsou pod tímto limitem velikosti, nazývaným difrakční limit. Vědci vyvíjejí "super-rozlišení" techniky, aby se dostali kolem tohoto limitu. Mikroskopie se strukturovanou osvětlenou mikroskopií (SIM) a stimulace stimulované emise (STED) jsou obě metody fluorescenční mikroskopie, které omezují velikost místa vyzařujícího světlo zmenšením velikosti bodu excitačního světla.
URL:https://cs.whycomputer.com/Hardware/100107040.html