Různé typy fluorescenčních mikroskopů

Od vzniku mikroskopů v 17. století se vědci snaží odhalit, co se skrývá pod povrchem. Fluorescenční mikroskopie umožňuje, aby vzorek po osvětlení sám vydával světlo, což výrazně zjednodušuje identifikaci struktur. Níže jsou popsány nejčastěji používané typy fluorescenčních mikroskopů.

Epifluorescence

Nejrozšířenějším typem je epifluorescenční mikroskop. Světelný zdroj (obvykle rtuťová nebo xenonová lampa) prochází výběrovým filtrem, který propouští úzký rozsah vlnových délek. Filtrované světlo dopadá na vzorek přes objektiv. Fluorofory ve vzorku absorbují kratší vlnovou délku a vyzařují delší vlnovou délku. Emise a rozptýlené světlo se vrací zpět do objektivu, kde je před dalším filtrem odděleno od excitačního světla a zachyceno detektorem nebo okem pozorovatele.

Konfokální mikroskopie

Epifluorescenční mikroskop zachycuje světlo ze všech hloubek vzorku, což vede k rozostření z‑out‑of‑focus oblastí. Konfokální mikroskop používá laserový paprsek zaostřený do roviny ostrosti a před detektor umístí pinhole, který propouští jen světlo pocházející z této roviny. Skenováním vzorku vzniká čistý trojrozměrný obraz s minimálním pozadím.

Multiphotonová mikroskopie

U konfokálního systému je nutné přesné zarovnání laseru, objektivu, optiky a pinholeu. Multiphotonová mikroskopie tento problém obchází tím, že používá dlouhou vlnovou délku (poloviční energii) a excitaci pouze při simultánním dopadu dvou fotonů. Tato dvojitá excitace nastává jen v úzce zaostřeném bodě, takže fluorescenční signál vzniká výhradně v místě zaměření laseru. Díky tomu není potřeba pinhole a obraz zůstává čistý.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

TIRF mikroskopie využívá totální vnitřní odraz k vytvoření evanescentního pole, které proniká jen několik set nanometrů do vzorku. Světlo je vedené pod úhlem do skleněné desky, kde téměř nepropadá do kapaliny, ale mírně uniká v tenké vrstvě těsně u povrchu. Výsledkem jsou obrazy omezené na tenkou oblast u skleněného substrátu – ideální pro studium procesů na membráně buněk, např. neuronů.

Super‑rozlišení

Všechny optické mikroskopy jsou omezeny difrakčním limitem – pro viditelné světlo přibližně 200 nm. Molekuly jsou však mnohem menší, takže mnoho detailů zůstává neviditelných. Super‑rozlišovací metody, jako je strukturovaná iluminace (SIM) nebo stimulovaná emisní deplece (STED), zmenšují velikost excitačního bodu a překonávají difrakční limit, což umožňuje zobrazit struktury v řádu několika nanometrů.